Рекомбинантные антитела против интерферона-гамма и его рецептора для терапии аутоиммунных заболеваний

Номер гранта:08-04-12192
Область научного знания:биология и медицинские науки
Тип конкурса: («офи»)(«офи») инициативные проекты ориентированных фундаментальных исследований
Год выполнения:2008г.
Руководитель: Кирпичников М.П.
Статус заявки:поддержана

Аннотация к отчету по результатам реализации проекта:

Из клеточных линий гибридом, были выделены семь антител против рекомбинантного интерферона- гамма (ИФН-гамма) и антитело против внеклеточного домена рецептора ИФН-гамма. Методом иммуноферментного анализа установлено, что константы аффинности всех исследуемых антител находятся в диапазоне 10-8 – 10-11 М. Определение нейтрализующей активности осуществляли двумя способами. Первый метод основывался на способности нейтрализующих антител подавлять противовирусную активность ИФН-гамма в отношении клеток WISH, инкубируемых в присутствии вируса везикулярного стоматита. Наряду с вышеописанным методом определяли способность моноклональных антител оказывать влияние на Th1/Th2 экспрессию цитокинов активированными лимфоцитами периферической крови человека. В отличие от анализа нейтрализующей активности антител на культуре клеток, где оценивали ингибирующий эффект МоАт на рекомбинантный ИФН-гамма, отличительная особенность предложенного метода заключается в изучении взаимодействия МоАт непосредственно с эндогенным ИФН-гамма человека. По результатам выполненных исследований для дальнейшего проведения экспериментов по химеризации были отобраны моноклональные антитела G1, F1, D4 (анти-ИФН-гамма) и антитело С3 против рецептора ИФН-гамма. Получение кДНК генов вариабельных доменов осуществляли методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции. По результатам секвенирования установили нуклеотидную и аминокислотную последовательности вариабельных доменов, проведено картирование участков гипервариабельности (CDR) и каркасных участков. Получение экспрессионных конструкций для биосинтеза химерных Fab-фрагментов антител включало в себя несколько этапов. На первой стадии была осуществлена сборка непосредственно химерных тяжелой и легкой цепей антител. На втором этапе происходило встраивание полученных химерных L и Fd – фрагментов к бицистронный экспрессионный вектор на основе плазмиды pTrc 99A. Особенностью полученной системы экспрессии является возможность накопления функционально-активных Fab фрагментов в среде культивирования. Начат процесс оптимизации условий процесса биосинтеза химерных Fab-фрагментов в клетках E.coli. Завершено создание лабораторного штамма-продуцента ИФН-гамма. Образование функционально-активного белка происходит в результате ренатурации из телец включения. Данная разработка позволила производить тестирование активности антител и определение эффективности экспрессионной системы на собственном препарате ИФН-гамма.
Аннотации к заявке и отчету приведены в авторской редакции. по состоянию на 29.03.2024.
Помог ли вам материал?
-1    2