Исследование механизма регуляции координированной экспрессии генов в форум-доменах человека: выявление белковых комплексов и некодирующих РНК, участвующих в этой регуляции

Номер гранта:18-04-00680
Область научного знания:биология и медицинские науки
Тип конкурса: (а)(а) конкурс проектов фундаментальных научных исследований
Год выполнения:2018г.
Руководитель: Кретова ОльгаВалерьевна
Статус заявки:поддержана

Аннотация к заявке:

Данный проект является логическим продолжением исследований, проводимых в нашей лаборатории многие годы и посвященных изучению экспрессии генов, организованных в координированно экспрессирующиеся кластеры в составе больших хромосомных доменов. Эти домены впервые были открыты в нашей лаборатории и получили название форум-доменов. Мы обнаружили, что гены, входящие в отдельные форум-домены, транскрибируются координированно, и что на границах доменов специфически связываются два белка - PARP1 и HNRNPА2B1 (Tchurikov, Kretova et al., PLoS Genetics, 2013). Эти результаты позволили предположить, что данные белки могут быть вовлечены в регуляцию координированной транскрипции в изучаемых доменах. Целью проекта и являются дальнейшие исследования в этом направлении: -во-первых, предполагается провести сравнение результатов полногеномной локализации горячих точек DSBs, полученных двумя независимыми методами - с помощью полногеномного картирования концов форум–доменов, и методом ChIP-Seq, используя такой общеизвестный маркер DSBs in vivo как ?-H2AX в клетках HEK293T, т.к. концы форум-доменов полногеномно прокартированы именно в этих клетках. Наши недавние исследования генов rDNA убедительно показали, что горячие точки DSBs и места локализации ?-H2AX точно совпадают (Tchurikov et al., 2016, Scientific Reports). Однако для всего генома человека это еще не было доказано; - во-вторых, провести полногеномное картирование мест связывания PARP1 в HEK293T методом ChIP-Seq. Ранее связывание этого белка с тотальными препаратами концевых областей форум-доменов, меченных биотином, проводили in vitro, вылавливая белки, специфически связывающиеся с такой ДНК на магнитных частицах, содержащих авидин. В этих экспериментах использовали ядерные белковые экстракты, в которых белковые комплексы разрушаются (высокая ионная сила); - в-третьих, для того, чтобы определить, в составе каких белковых или РНП-комплексов PARP1 связывается на границах форум-доменов, будут использованы ядерные экстракты, выделенные с помощью растворов с низкой ионной силой, в которых белковые и РНП-комплексы не разрушаются. Для анализа смеси белков, специфически связывающихся с полногеномными препаратами форум-доменов, меченными биотином (см. предыдущий пункт), будут использованы самые современные подходы. Они включают протеомный анализ iTRAQ/TMT c последующим масс-спектрометрическим анализом на Orbitrap LC-MS/MS для качественной и количественнной детекции белков, составляющих регуляторные комплексы, а также PAR-CLIP, подход для определения спектра некодирующих РНК разных классов, входящих в эти комплексы. В результате выполнения проекта, несомненно, будут получены результаты мирового уровня. Полученные нами данные позволят пролить свет на механизмы координированного сайленсинга или активации транскрипции генных кластеров внутри крупных хромосомных доменов, которые защищены от внутридоменной фрагментации, ограничены неслучайно расположенными горячими точками двухцепочечных разрывов и сайтами связывания PARP1 и HNRNPA2B1. Новая научная идея – координированная экспрессия генов в форум-доменах. Будут выяснены механизмы такой регуляции, в частности, роль PARP1, белков, входящих в комплекс с PARP1, а также некодирующих РНК. Также наши данные прояснят взаимоотношения между ломкими сайтами в хромосомах (горячими точками DSBs), доменной организацией хромосом и регуляцией экспрессии генов. Это важно с точки зрения канцерогеномики и генотерапии.
Аннотации к заявке и отчету приведены в авторской редакции. по состоянию на 16.11.2018.
Помог ли вам материал?
1    0