Создание бакуловирусных векторов нового поколения для эффективного переноса и экспрессии генов в клетках эукариот

Номер гранта:07-04-12136
Область научного знания:биология и медицинские науки
Тип конкурса: («офи»)(«офи») инициативные проекты ориентированных фундаментальных исследований
Год выполнения:2007г.
Руководитель: Кочетков С.Н.
Статус заявки:поддержана

Аннотация к заявке:

Дальнейшее совершенствование эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать эукариотические белки in vitro и in vivo для использования в фундаментальных исследованиях, создания современных стратегий диагностики, лечения, а также генотерапии системных заболеваний человека, представляет собой важную научную задачу. Способность бакуловируса передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих послужила основанием для использования бакуловирусных векторов и в экспрессионной системе животных клеток. Решение задачи, связанной с разработкой новых вирусных векторов на основе бакуловируса для эффективного переноса и экспрессии функциональных генов in vitro и in vivo планируется проводить путем создания конструкций для экспрессии структурных белков вируса гепатита С. Частицы, подобные частицам вируса гепатита С, содержащие структурные белки вируса, предполагается получать при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках Sf9 и Huh7 и использовать в качестве модели вириона ВГС для изучения процесса сборки вирусной частицы, влияния ингибиторов на морфогенез и способность вируса связываться с клеткой. Проектом предусматривается создание генетических конструкций на основе бакуловирусного трансфер-вектора pFastBacHT с экспрессирующей кассетой под контролем промотора цитомегаловируса, с репортерным геном GFP для направленной доставки и экспрессии генов в клеточных линиях человека и животных. С использованием сконструированных бакуловирусных конструкций в клетках Sf9 и в клетках Huh7, способных поддерживать длительную репликацию вирусной РНК, предполагается исследовать белок-белковые взаимодействия между структурными белками ВГС, их пост-трансляционные модификации и формирование вирусоподобных частиц, морфологически подобных вирионам ВГС. Ингибиторный анализ гликозилирования структурных белков ВГС и исследование влияния ингибиторов на способность вируса связываться с клеткой планируется проводить на вирусоподобных частицах в клеточных культурах насекомых и млекопитающих.

Аннотация к отчету по результатам реализации проекта:

Для оптимизации бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых сконструированы бакуловирусные векторы с маркерными генами для селективного отбора рекомбинантных вирусов. Cозданы генетические конструкции на основе бакуловирусного трансфер-вектора pFastBacHT с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса(CMV), содержащие репортерный ген GFP, сигнал полиаденилирования (SV40pA) и полилинкер (MCS) для направленной доставки и экспрессии генов в клеточных линиях человека и животных. Ппроведены следующие работы: - получены бакуловирусные векторные плазмиды на основе pFastBacHT, содержащие кДНК зеленого и красного флюоресцирующих белков. - получены три бакуловирусных вектора pFastBacMamGFP1,pFastBacMamGFP2 и pFastBacMamGFP3 с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV), содержащие GFP, SV40pA и полилинкер MCS. - получены рекомбинантные клетки Huh7 и HEK293, трансфицированные полученными конструктами. - трансфекция клеток HEK293 полученными конструктами с последующей прямой оценкой эффективности экспрессии флуоресцентного белка непосредственно в живых клетках показала, что рекомбинантные бакуловирусные векторы pFastBacMamGFP1-3 могут быть использованы для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в клеточных линиях человека и животных. - получены рекомбинантные бакуловирусы продуцирующие структурные белки вируса гепатита С и вирусоподобные частицы ВГС в зараженных клетках насекомых. - получены конструкции на основе векторов pFastBacMamGFP, содержащие последовательности кДНК гетеродимера Е1-Е2 ВГС и кДНК core-E1-E2 ВГС. - получены рекомбинантные клетки Huh7 и HEK293, трансфицированные полученными рекомбинантными pFastBacMamGFPЕ1-Е2 и pFastBacMamGFP3core-E1-E2 с положительной прямой оценкой эффективности экспрессии флуоресцентного белка непосредственно в живых клетках.
Аннотации к заявке и отчету приведены в авторской редакции. по состоянию на 06.12.2021.
Помог ли вам материал?
0    0