Создание бакуловирусных векторов нового поколения для эффективного переноса и экспрессии генов в клетках эукариот
Номер гранта: | 07-04-12136 |
Область научного знания: | биология и медицинские науки |
Тип конкурса: | («офи»)(«офи») инициативные проекты ориентированных фундаментальных исследований |
Год выполнения: | 2007г. |
Руководитель: | Кочетков С.Н. |
Статус заявки: | поддержана |
Аннотация к заявке:
Дальнейшее совершенствование эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать эукариотические белки in vitro и in vivo для использования в фундаментальных исследованиях, создания современных стратегий диагностики, лечения, а также генотерапии системных заболеваний человека, представляет собой важную научную задачу. Способность бакуловируса передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих послужила основанием для использования бакуловирусных векторов и в экспрессионной системе животных клеток. Решение задачи, связанной с разработкой новых вирусных векторов на основе бакуловируса для эффективного переноса и экспрессии функциональных генов in vitro и in vivo планируется проводить путем создания конструкций для экспрессии структурных белков вируса гепатита С.
Частицы, подобные частицам вируса гепатита С, содержащие структурные белки вируса, предполагается получать при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках Sf9 и Huh7 и использовать в качестве модели вириона ВГС для изучения процесса сборки вирусной частицы, влияния ингибиторов на морфогенез и способность вируса связываться с клеткой. Проектом предусматривается создание генетических конструкций на основе бакуловирусного трансфер-вектора pFastBacHT с экспрессирующей кассетой под контролем промотора цитомегаловируса, с репортерным геном GFP для направленной доставки и экспрессии генов в клеточных линиях человека и животных. С использованием сконструированных бакуловирусных конструкций в клетках Sf9 и в клетках Huh7, способных поддерживать длительную репликацию вирусной РНК, предполагается исследовать белок-белковые взаимодействия между структурными белками ВГС, их пост-трансляционные модификации и формирование вирусоподобных частиц, морфологически подобных вирионам ВГС. Ингибиторный анализ гликозилирования структурных белков ВГС и исследование влияния ингибиторов на способность вируса связываться с клеткой планируется проводить на вирусоподобных частицах в клеточных культурах насекомых и млекопитающих.
Аннотация к отчету по результатам реализации проекта:
Для оптимизации бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых сконструированы бакуловирусные векторы с маркерными генами для селективного отбора рекомбинантных вирусов. Cозданы генетические конструкции на основе бакуловирусного трансфер-вектора pFastBacHT с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса(CMV), содержащие репортерный ген GFP, сигнал полиаденилирования (SV40pA) и полилинкер (MCS) для направленной доставки и экспрессии генов в клеточных линиях человека и животных. Ппроведены следующие работы:
- получены бакуловирусные векторные плазмиды на основе pFastBacHT, содержащие кДНК зеленого
и красного флюоресцирующих белков.
- получены три бакуловирусных вектора pFastBacMamGFP1,pFastBacMamGFP2 и pFastBacMamGFP3
с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV), содержащие GFP, SV40pA и
полилинкер MCS.
- получены рекомбинантные клетки Huh7 и HEK293, трансфицированные полученными конструктами.
- трансфекция клеток HEK293 полученными конструктами с последующей прямой оценкой
эффективности экспрессии флуоресцентного белка непосредственно в живых клетках показала, что
рекомбинантные бакуловирусные векторы pFastBacMamGFP1-3 могут быть использованы для направленной
доставки и экспрессии эукариотических генов в клеточных линиях человека и животных.
- получены рекомбинантные бакуловирусы продуцирующие структурные белки вируса гепатита С и вирусоподобные
частицы ВГС в зараженных клетках насекомых.
- получены конструкции на основе векторов pFastBacMamGFP, содержащие последовательности кДНК гетеродимера
Е1-Е2 ВГС и кДНК core-E1-E2 ВГС.
- получены рекомбинантные клетки Huh7 и HEK293, трансфицированные полученными рекомбинантными
pFastBacMamGFPЕ1-Е2 и pFastBacMamGFP3core-E1-E2 с положительной прямой оценкой эффективности
экспрессии флуоресцентного белка непосредственно в живых клетках.
Аннотации к заявке и отчету приведены в авторской редакции.
по состоянию на 29.03.2024.