Структурные и молекулярно-генетические механизмы инициации боковых корней в апикальной меристеме материнского корня

Проект направлен на выяснение структурных, молекулярно-генетических и физиологических механизмов контроля одной из стратегий образования органов высшего растения – инициации боковых корней в меристеме родительского корня. Данный проект является логическим продолжением работ, поддержанных РФФИ в предыдущие годы. На основе полученных ранее экспериментальных данных нами выдвинуто и будет проверено предположение о существовании особых механизмов регуляции инициации примордиев боковых корней непосредственно в апикальной меристеме родительского корня, когда место инициации примордия бокового корня находится в окружении пролиферирующих клеток других слоев. Несмотря на значительные успехи последнего времени в решении фундаментальных проблем биологии развития растений, вопросы о механизме вовлечения фитогормонов в поддержание активности меристем и формирование новых органов, до сих пор остаются открытым. Исходя их этого, будет проведен анализ пространственного распределения и транспорта фитогормонов (ауксина и цитокининов) в кончике корня в связи с инициацией боковых корней в меристеме материнского корня (с использованием локализации активности генов первичного ответа на эти фитогормоны). В этих целях будут получены трансгенные корни кабачка, несущие конструкции промоторов генов первичного ответа на ауксины и цитокинины (DR5 и ARR5, соответственно), слитые с репортерными генами. Также планируется выявление роли и механизмов регуляции функционирования белков-переносчиков ауксина (семейств PIN и AUX) в процессах инициации боковых корней в меристеме родительского корня. Планируется сравнительный анализ регуляции экспрессии генов CRINKLY, WOX и KNAT, вовлеченных в контроль начальных этапов инициации боковых корней у растений, различающихся по положению места инициации бокового корня относительно продольной оси материнского корня (Arabidopsis thaliana, огурец – Cucumis sativa и кабачок – Cucurbita pepo). В целях изучения роли генов кабачка CRINKLY и WOX5 на различных стадиях развития примордиев боковых корней планируется определить место их экспрессии путём локализации РНК-РНК гибридизации транскриптов in situ. Значительную часть проекта составят работы по выявление структурных особенностей клеток перицикла и эндодермы, вовлекаемых в формирование примордия бокового корня в меристеме родительского, а также анализ роли изменения длительности митотического цикла в отдельных клетках перицикла и эндодермы при детерминации их к инициации бокового корня в меристеме родительского. Анализ полученных в ходе работы над проектом результатов выявит структурные и молекулярные механизмы способности высших растений инициировать развитие бокового корня непосредственно в меристеме родительского.

В мировой литературе долгие годы существует точка зрения, что фитогормон ауксин является ключевым триггером процессов инициации и формирования бокового корня. Обширная литература свидетельствует о том, что при возникновении бокового корня выше зоны растяжения материнского корня необходимо возобновление пролиферации клеток перицикла, и именно локальное повышение концентрации ауксина в клетках перицикла запускает процессы инициации бокового корня. Однако у цветковых растений существуют и иные стратегии инициации боковых корней. Одной из главных задач проекта в 2011 году стал анализ распределения клеточного ответа на фитогормоны в кончике корня Тыквенных в связи с инициацией примордиев боковых корней, которая у данных растений происходит непосредственно в меристеме, а не на значительном удалении от кончика корня (за зоной растяжения), как это характерно для многих цветковых растений. Для визуализации клеточного ответа на ауксины и цитокинины созданы молекулярные конструкции, содержащие слитый репортерный ген зелёного флуоресцентного белка и ?-глюкуронидазы под управлением ауксин-чувствительного (DR5::gfp-gusA) или цитокинин-чувствительного (AtARR6::gfp-gusA) промоторов. Создана новая технология агробактериальной (Agrobacterium rhizogenes) трансформации растений кабачка и получены композитные растения, корни которых несли заданные конструкции. Проведен анализ распределения ответа на ауксин и цитокинин в тканях кончика корня кабачка (Cucurbita pepo). В ходе реализации проекта в текущем году было установлено, что у тех растений, у которых боковой корень инициируется непосредственно в меристеме родительского корня (а не выше зоны растяжения) не происходит возобновления пролиферации клеток, иницирующих примордий бокового корня. Клетки всех тканей корня в этой зоне активно пролиферируют. Локальный максимум ауксина формируется лишь после завершения первых периклинальных делений клеток перицикла, инициирующих примордий бокового корня. Также было показано, что у таких растений (на примере кабачка) экзогенный ауксин (НУК) в высоких концентрациях, а также блокатор активного транспорта ауксина (1-нафтоксиуксусная кислота) не оказывают воздействия на распределение сайтов инициации бокового корня. Среднее число формируемых примордиев на 100 клеток коры, так называемый «индекс инициации бокового корня», остается неизменным. Эти данные позволили сделать вывод об отсутствии зависимости определения места инициации примордия бокового корня от локального повышения концентрации ауксина в случае инициации бокового корня в апикальной меристеме родительского корня. За отчетный период также были начаты работы по клонированию промоторов генов CRINKLY, WOX5 и KNAT1/6, вовлеченных в контроль начальных этапов инициации боковых корней у растений, различающихся по положению места инициации бокового корня относительно продольной оси материнского корня (Arabidopsis thaliana, огурец – Cucumis sativa). В 2011 году по тематике проекта опубликованы 2 статьи в реферируемых международных журналах, одна статья принята к печати, сделано 6 научных докладов.