Структурные и генетические основы формирования компетенции клеток корня растения к образованию клубеньковых эндосимбиозов

Проект направлен на выяснение структурных и молекулярно-генетических предпосылок возникновения компетенции клетки растения к проникновению бактериальных микросимбионтов и формирования азотфиксирующих симбиотических клубеньков высших растений. Данный проект является логическим продолжением работ поддержанных РФФИ в предыдущие годы. На основе полученных ранее экспериментальных данных, нами выдвинуто и будет проверено предположение о существовании связи процесса колонизации при клубеньковом симбиозе с положением клетки корневого клубенька в митотическом цикле. Предполагается выявление механизмов образования компетенции клеток растения к колонизации их микросимбионтом при двух различных типах азотфиксирующего клубенькового эндосимбиоза: (а) ризобиальные недетерминированные клубеньки бобовых – Pisum sativum и Medicago truncatula; (б) актиноризные клубеньки: Casuarina glauca и Datisca glomerata. Будут проанализированы паттерны экспрессии и функционирования двух групп генов. Первая, гены растения, регулирующие продвижение и выход клетки из митотического цикла (CCS52 и CYCD3;1) у актиноризных и ризобиальных растений. Путем получения культуры трансгенных клубеньков Medicago truncatula и Datisca glomerata с измененным уровнем экспрессии этих генов, будет изучена роль эндоредупликации (этап контролируется геном CCS52) в способности клетки растения к колонизации почвенными бактериями. Вторая, регуляторные симбиотические гены Pisum sativum – SYM33, SYM40 и SYM41, контролирующие формирование тканевой архитектуры клубенька и согласование процессов роста и пролиферации клеток при его образовании. Анализ хода митотического цикла в клетках зоны инфекции актиноризных клубеньков в сочетании с анализом функционирования специфических симбиотических генов гороха является пионерским и составит основное преимущество данного проекта. Предполагаемая работа базируется на значительном научном заделе авторского коллектива и разносторонности его научных интересов. Особое внимание в проекте уделено современным методическим подходам: конфокальная микроскопия, иммунолокализация белков, 3D-реконструкция процесса колонизации клеток актиноризного клубенька и манипуляция экспрессией отдельных генов растения, вовлеченных в регуляцию прохождения клеточного цикла. Анализ полученных в ходе работы над проектом результатов выявит структурные и молекулярные механизмы способности высших растений формировать эффективные симбиотические связи с микроорганизмами почвы.

В ходе реализации проекта в текущем году было установлено, что для нормального формирования примордия ризобиального клубенька бобовых с недетерминированным типом развития возможно и необходимо проникновение инфекционных нитей в его активно пролиферирующие клетки. В мировой литературе долгие годы существовала точка зрения о невозможности такого пути развития клеток клубенька (см. Kondorosi, Kondorosi, 2004). С применением мутационного подхода, анализа пролиферации клеток и лазерной сканирующей микроскопии у дикого типа и мутантов Pisum sativum RisFixA, SGEFix–-2, SGEFix–-1, RBT3 показано, что, как минимум, два гена PsSym33 и PsSym41 определяют компетенцию проникновения (построения) инфекционной нити в пролиферирующие клетки примордия ризобиального клубенька с недетерминированным типом развития. За отчетный период методом 3D реконструкции с применением лазерной сканирующей микроскопии изучен паттерн инфекционного процесса и динамика пролиферации клеток в актиноризных клубеньках у модельных растений. Нами было показано, что в ходе колонизации клеток актиноризного корневого клубенька почвенными симбиотическими бактериями Frankia, эндоредупликация ДНК в клетке не является обязательным и предшествующим условием. Колонизация клетки эндосимбионтом возможна как после реактивации митотического цикла (Datisca glomerata – интерцеллюлярный тип инфекции), так и без нее (Casuarina glauca – интрацеллюлярный тип инфекции). Реактивация клеточного цикла всегда происходит путем перехода покоящихся в G1/G0-фазе митотического цикла клеток к синтезу ДНК и предшествует непосредственному внедрению микросимбионта. Эндоредупликация ДНК в инфицированной (колонизованной) клетке является вторичным процессом и начинается уже после внедрения эндосимбионта. Продолжены работы по определению нуклеотидной последовательности генов-регуляторов клеточного цикла (циклина CycD3;1 и переключателя эндоредупликации CCS52) у Datisca glomerata для создания трансгенного конструкта и манипуляцией уровнем экспрессии этих генов. В актиноризных клубеньках Datisca glomerata обнаружена экспрессия двух генов семейства CCS52: CCS52A и CCS52В. В 2008 году по тематике проекта опубликована 1 статья в реферируемом международном журнале, 2 статьи в сборниках, сделано 4 научных доклада, одна статья подготовлена к печати.