Развитие методов рентгеновской дифрактометрии и нейтронной рефлектометрии для исследования структуры и свойств биологических макромолекул

Номер гранта:12-02-12053
Область научного знания:физика и астрономия
Тип конкурса: (офи-м, «офи_м»)(«офи_м») ориентированные фундаментальные исследования по междисциплинарным темам, (офи-м, «офи_м») (офи-м) конкурс ориентированных фундаментальных исследований по актуальным междисциплинарным темам
Год выполнения:2012г.
Руководитель: Благов А.Е.
Статус заявки:поддержана

Аннотация к заявке:

Исследования структуры и свойств белковых молекул и их комплексов, составляют неотъемлемую и существенную часть работ по изучению механизмов функционирования белков в различных биологических процессах, которые позволяют решать фундаментальные и прикладные проблемы медицины, например, разрабатывать новые лекарственные средства, изучать процессы происходящие при развитии болезней, а также создавать функциональные гибридные элементы для различных био- и нанотехнологических применений (биокатализаторов, синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских приложений, устройств обработки информации и различных биосенсоров, и пр.). Наиболее распространенными методами исследования структуры белковых макромолекул и различных белковых комплексов (в том числе, нуклеопротеидных) являются рентгеновская кристаллография, электронная микроскопия и конфокальная оптическая микроскопия. Одними из наиболее перспективных методов для исследования белковых молекул в растворах, в условиях приближенных к существующим в живых организмах, являются методы нейтронного и рентгеновского рассеяния, такие как малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН), малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР), нейтронное спин-эхо (НСЭ). В последнее время для исследования структур на основе белков стал успешно применяться метод стоячих рентгеновских волн. В связи с этим в настоящем проекте предполагается развитие таких рентгеновских методов (рентгенодифракционных, фазочувствительных, спектрально-селективных), как высокоразрешающая двухкристальная дифрактометрия, многоволновая дифракция, метод стоячих рентгеновских волн (СРВ) и рентгеновская рефлектометрия, которые позволяют получить структурную информацию с высоким пространственным и спектральным разрешением для исследования структур на основе белков, а также получить новую информацию об их свойствах, дефектной структуре и особенностях формирования гибридных систем. Предполагается использовать указанные методы для изучения процессов образования белковых кристаллов, процессов формирования белково-липидных систем и исследования структурных особенностей таких объектов, в частности: белковых растворов, монослоев на поверхности жидкости и наноразмерных пленок на твердых подложках, объемных кристаллов и кристаллических пленок. Развитие этих методов особенно перспективно в комплексе с применением нейтронных методов исследования. Предполагается использовать малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН), которое позволяет получить более детальную информацию о структуре и динамике нуклеопротеидных комплексов и сложных биологических систем в широком диапазоне характерных размеров в растворе, т.е. в условиях, близких к нативным. Вместе с тем, данные малоуглового рассеяния не позволяют однозначно решить задачу реконструкции структуры биомакромолекулы или ее динамики. В связи с этим планируется развитие подходов, интегрирующих эти данные с результатами молекулярного (в том числе молекулярно-динамического) моделирования.

Аннотация к отчету по результатам реализации проекта:

Выполнен первый этап программы, основная задача которой, - развитие методов и подходов для структурно-динамических исследований белковых макромолекул, нуклеопротеидных и белково-липидных комплексов на основе взаимодополняющих рентгеновских и нейтронных исследований с привлечением фазочувствительных и спектрально селективных методов. В течение первого этапа выполнения проекта (этап 2012 г.) проведены подготовительные работы для выполнения рентгеновских и нейтронных экспериментов, проведено моделирование объектов исследования и экспериментальных спектров и отработаны методики и проведены предварительные эксперименты. Задачи первого этапа исследований выполнены полностью. Проведено исследование рекомбинационного комплекса, с помощью молекулярно-биологических методов, биохимических, а также методов молекулярного моделирования, малоуглового рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей. (а) впервые построено семейство возможных полноатомных моделей комплекса пресинаптического филамента, образованного бактериальным белком RecA из E.coli, с белком RecX, (б) произведен расчет спектров малоуглового рассеяния нейтронов для полученных полноатомных моделей системы, (в) проведены измерения и сравнительный анализ спектров комплексов белка RecX, RecA и однонитевой ДНК, с использованием метода малоуглового нейтронного рассеяния и (г) измерены спектры малоуглового рентгеновского рассеяния белка Tip49a в отсутствии кофакторов, в присутствии негидролизуемого аналога АТФ (АДФ-?-тиофосфат), двунитевой ДНК, и обоих этих кофакторов. Впервые получены достоверные полноатомные модели комплексов белка RecA с тремя нитями ДНК, а также данные о динамике филамента белка RecA на временах от 10пс до 10мкс секунд. Созданы прототипы оригинального программного обеспечения и произведены необходимые расчеты, позволяющие проведение экспериментальной проверки результатов моделирования с использованием методов малоуглового рассеяния нейтронов, малоуглового рентгеновского рассеяния и нейтронного спин-эхо. Кроме того, созданы модели крупномасштабной упаковки хроматина в ядрах клеток и проведены предварительные эксперименты с использованием методов малоуглового рассеяния нейтронов, атомно-силовой и конфокальной микроскопии, направленные на экспериментальную верификацию этих моделей. На основе имеющихся структурных данных (PDB ID: 4E1A, 3UC5) построена модель фосфопантетеин аденилилтрансферазa из Mycobacterium tuberculosis (РРАТ Mt) в комплексе с лигандом до начала конформационного изменения. Проведено моделирование динамики молекулы от начального до конечного состояния, сопровождающего связывание лиганда. Получена временная модель данного конформационного изменения. В настоящее время производится анализ полученной модели. Отработана методика кристаллизации белков в специально изготовленной ячейке, позволяющей проводить дальнейшие исследования полученных белковых кристаллов рентгеновскими методами. Проведена отработка методики кристаллизации белков как на неорганических (кремниевых) подложках, покрытых естественным слоем окисла, так и на кремниевых подложках, подложках с нанесённым микрорельефом методом искусственной эпитаксии на примере белка с хорошо изученной структурой – лизоцима. Получены многослойные липидные системы на кремниевых подложках, в том числе содержащие ионы тяжелого металла. Методами рентгеновской рефлектометрии и стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения проведено исследование их структуры.
Аннотации к заявке и отчету приведены в авторской редакции. по состоянию на 28.03.2024.

Фотогалерея:

Кристаллизатор для экспериментов Исследование зарождения и роста кристалла
Помог ли вам материал?
26    10