Внешние НАД(Ф)Н оксидоредуктазы митохондрий NOX4, AIF и Cyb5R3 в регуляции митохондриальных функций и клеточной гибели в патологических состояниях.

Проект направлен на исследование одного из актуальнейших вопросов современной биомедицины: поиск и идентификацию новых систем регуляции гибели или устойчивости клеток в различных патологических состояниях организма, включая ишемию/реперфузию и противоопухолевую лекарственную терапию. В рамках проекта будет проведено изучение роли НАД(Ф)Н оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий (NOX4, AIF и Cyb5R3) в регуляции неспецифической митохондриальной поры (мРТР), пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны для апоптогенных факторов (МОМР) и в передаче апоптотического сигнала на уровне каспаз 8, 3 и 9. В частности, будут экспериментально проверены три гипотезы. 1. Механизмами подавления апоптоза и активации пролиферации клеток со стороны NOX4 на уровне митохондрий являются окислительная модификация внешних митохондриальных редокс-сенсоров и подавление открывания мРТР и МОМР; АФК-зависимая активация митохондриальных К+ каналов (митоКАТФ) и подавление мРТР; АФК-зависимое подавление активности каспаз 8, 3 и 9. 2. Регуляция открывания мРТР и выхода апоптогенных факторов из митохондрий с участием Cyb5R3 митохондрий осуществляется по одному или нескольким приведенным механизмам: спонтанная генерация активных форм кислорода (АФК), окислительная модификация митохондриальных редокс-сенсоров и подавление открывания мРТР с участием митоКАТФ каналов; реактивация аскорбил-радикала и подавление перекисного окисления липидов в условиях окислительного стресса; активация редокс-активных ксенобиотиков; восстановление / окисление стероидных гормонов до активных производных, способных модифицировать тиоловые группы и активировать продукцию АФК в митохондриях; регуляция активности митоКАТФ каналов и проводимости мРТР за счет участия в метаболизме N-гидрокси-L-аргинина и оксида азота.3. Ассоциированный с митохондриями AIF является важным регулятором мРТР и МОМР за счет генерации АФК в отсутствии и присутствие редокс-активных ксенобиотиков, регуляции К+ транспорта и Са2+-емкости митохондрий, или за счет участия в молекулярных взаимодействиях с предполагаемыми компонентами МОМР (Bax, Bak, tBid, VDAC). Полученные данные позволят сделать заключение о роли внешних митохондриальных НАД(Ф)Н оксидоредуктаз в регуляции клеточной гибели в различных патологических состояниях.

В рамках решения основных задач проекта были проведены исследования и получены следующие результаты. С использованием специфических ингибиторов Cyb5R3, блокаторов каналов VDAC, а также клеточных линий, с подавленной экспрессией Cyb5R3 и различных изоформ VDAC показано, что Cyb5R3 является основной редуктазой ксенобиотиков, природных соединений и гемопротеинов, стандартный редокс потенциал которых >= -170 мВ. Различные изоформы VDAC, в первую очередь, VDAC2, не являются НАДН оксидоредуктазами, но способны регулировать уровень АФК в митохондриях и клетках за счет облегчения входа и выхода АФК и свободных радикалов из цитозоля и матрикса митохондрий, соответственно. Эндогенный цитохром с митохондрий способен эффективно утилизировать свободные радикалы. Подавление трансляции изоформы 1 Cyb5R3 приводит к наработке другой изоформы меньшей массы, которая, по-видимому, не является мембраносвязанной. Клоны ее экспрессирующие демонстрировали другую чувствительность к цитотоксическому действию ксенобиотиков и скорость генерации АФК в их присутствии. Однако, цитостатические и цитотоксические эффекты оксида азота на клетки HEK293T экспрессирующие разные формы Cyb5R3 были сходными. Это, по-видимому, отражает низкое содержание в цитозоле клеток (в нормальных условиях) белков-глобинов - партнеров Cyb5R3, участвующих в утилизации NO*. При этом, Cyb5R3 митохондрий эффективно реактивировали Met-миоглобин и утилизировали экзогенный оксид азота, снижая эффект последнего на скорость дыхания. Для быстрой оценки эффектов различных модуляторов митохондриальных функций в условиях гипоксии/реоксигенации нами была разработана соответствующая модель для митохондриальной суспензии и многолуночных планшетов, которая, с одной стороны, хорошо воспроизводит условия in situ, а с другой позволила сделать ряд важных наблюдений. В частности, продемонстрирована роль различных субстратов дыхания в поддержании трансмембранного потенциала митохондрий в условиях гипоксии/аноксии и проанализированы различные механизмы данного явления. Кроме того, показано, что вредоносный эффект триклозана на организм млекопитающих связан с ингибированием комплекса II дыхательной цепи митохондрии в необычном сайте, что может лежать в основе опухолевой трансформации тканей. Вестерн блот анализ показал наличие NOX4 (различные изоформы и продукты протеолиза) в митохондриях почек, печени и клеток различных линий. Однако, масс-спектрометрический анализ образцов очищенных митохондрий печени и клеток MEF не выявил NOX4, NOX2 или p22phox. Это не позволяет нам сделать вывод о присутствии NOX4 в митохондриях, но не исключает возможность ее воздействия на митохондриальные структуры. Содержание NOX4 было повышено в клетках с подавленной экспрессией различных изоформ VDAC, что согласуется с представлением о NOX4, как о стресс-индуцируемом белке. С использованием специфических ингибиторов, блокаторов VDAC, четырех методов регистрации АФК и оригинального метода оценки активности НАД(Ф)Н оксидоредуктаз мы исследовали способность Cyb5R3, AIF и НАДФН оксидаз в митохондриях (и гомогенатах) спонтанно генерировать АФК. По нашим данным, Cyb5R3 и AIF не генерируют АФК в детектируемых количествах. NOX4 либо генерирует пероксид водорода, либо супероксид анион в просвет органелл. Показано, что в определенных условиях NOX4 или другие генераторы эндогенных АФК, принципиально способны ингибировать индукцию мРТР. При этом, в условиях in situ, эффект на активность каспаз, по-видимому, незначителен. Эксперименты не подтвердили участие Cyb5R3 в аскорбат-опосредованной защите митохондрий от индукции мРТР в присутствие прооксидантов и Са2+. Наша гипотеза о том, что эффекты некоторых стероидных гормонов и их производных на митохондрии могут быть связаны с продуктами их окисления/ восстановления системой Cyb5R3-Cyb5OM пока не получила экспериментального подтверждения. Однако исследования в данном направлении будут продолжены.