Деградация пероксисом у растений и ее роль в регуляции размера пула пероксисом и уровня АФК в растительных клетках

Активные формы кислорода (АФК), такие как перекись водорода, синглетный кислород, супероксид, в биологических системах являются потенциально опасными молекулами и могут вызывать значительные повреждения клеток и их функций. В растениях имеются мощные антиоксидантные системы для удаления этих соединений. У эукариот значительная часть оксидаз, генерирующих перекись водорода, сосредоточена в пероксисомах, где образовавшаяся перекись водорода немедленно разлагается каталазой. В пероксисомах растений, кроме каталазы, локализованы антиоксидантные системы супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза и монодегидроаскорбатредуктаза. Все это указывает на важную роль пероксисом как в продукции, так и в утилизации АФК в клетках растений. В проекте предполагается исследовать взаимосвязь между размером пула пероксисом и уровнем АФК в растительной клетке. При этом особое внимание будет уделено исследованиям специфической деградации пероксисом в ходе автофагии и пексофагии. Автофагия – это катаболический процесс деградации «маловажных» компонентов цитоплазмы и органелл в вакуоли в условиях недостатка питания, приводящий к высвобождению необходимых элементов и энергии, что позволяет клетке пережить неблагоприятный период. Элиминация ненужных или поврежденных клеточных компонентов также может осуществляться по автофагическому пути. Разборка пероксисом может происходить вместе с другими компонентами цитоплазмы в ходе автофагии, либо быть специфичной (т.н. пексофагия). В ходе выполнения проекта будут определены физиологические условия, при которых в клетках растений протекает авто-и/или пексофагия, и подобраны ингибиторы, позволяющие влиять на этот процесс и тем самым изменять размер пула пероксисом в клетках. Для визуализации пероксисом будут использованы трансгенные линии Arabidopsis thaliana, конститутивно экспрессирующие желтый флуоресцирующий белок, снабженный сигнальной последовательностью PTS1 (peroxisomal targeting signal 1). В растениях с измененным размером пероксисомного пула будет проведено сравнение содержания АФК в стрессовых условиях, способствующих образованию АФК. Кроме того, в ходе выполнения проекта будет исследована возможная роль белка AtATG1a из Arabidopsis thaliana, одного из гомологов белков комплексаATG1/ATG13, регулирующего автофагию в клетках дрожжей, в процессах авто- и пексофагии у растений. Будут получены новые данные, характеризующие малоизученные у растений процессы авто- и пексофагии, и созданы модели, позволяющие исследовать роль АФК в растительных клетках при изменении уровня АФК путем изменения размера пероксисомного пула клеток.

Проект посвящен исследованию процессов специфической деградации пероксисом в ходе автофагии и пексофагии в растительных клетках. Особое внимание уделяется роли это процесса в регуляции размера пула пероксисом и уровня АФК в клетках. В ходе первого года работы над проектом проводились эксперименты, позволяющие определить модельные условия, индуцирующие автофагию и/или пексофагию у Arabidopsis на примере растений p35S-EYFP>SKL(Col 0) с пероксисомами, маркированными желтым флуоресцирующим белком, что делает возможным их визуализацию. Такими условиями оказалось помещение трехнедельных проростков, выращиваемых на среде Мурасиге-Скуга с витаминами, минеральными элементами и 1% сахарозы, на среду без сахарозы с недостатком азота (50% по сравнению с нормой). У таких проростков помещение в темноту приводило к индукции автофагии через 1-3 дня, что сопровождалось снижением числа пероксисом (визуальная оценка). Проведены исследования проростков p35S-EYFP>SKL(atg1a), мутантных по гену, кодирующему протеинкиназу Atg1a, гомологичную компоненту комплекса ATG1а/ATG13а, ответственного за образование автофагосом дрожжей. Проростки выращивались на средах с недостатком азота и/или углерода, однако, выявить мутантный фенотип в этих опытах не удалось. Другой модельной системой стало затенение отдельных листьев взрослых растений Arabidopsis, выращиваемых на почве. У таких растений пятидневное затенение приводило к выраженному старению листьев и снижению числа пероксисом в клетках (визуальная оценка). Показано, что ингибитор автофагии 3-метиладенин препятствовал снижению числа пероксисом при старении листьев. У указанных модельных систем (проростки и стареющие листья) не удалось выявить изменений в пуле АФК с помощью спектрофотометрических и гистохимических методов, что указывает на высокую степень регуляции уровня АФК в клетках даже в условиях автофагии и пексофагии. Однако, на примере гетеротрофной суспензионной культуры клеток табака удалось показать взаимосвязь между снижением содержания каротиноидов в клетках, ингибированием автофагии и накоплением пероксисом, что может указывать на развитие окислительного стресса при ингибировании конститутивной автофагии и накоплении дефектных пероксисом на фоне 3-метиладенина.